La génétique mitochondriale - L'hétéroplasmie> de l'ADN mitochondrial :
les mitochondries possèdent leur propre molécule d'ADN (ADNmt) circulaire, double brin long de 16569 paires de bases. L'ADNmt code pour 13 polypeptides mitochondriaux des complexes des oxydations phosphorylantes parmi approximativement 70. Il est important de réalisez que dans de nombreuses cellules il y a des centaines de mitochondries , chacune abritant de 2 à 10 molécules d'ADNmt ; une cellule peut donc posséder plusieurs centaines voire quelques milliers de molécules d'ADNmt. Un gène codé par l'ADNmt est donc représenté à des milliers d'exemplaires contrairement à un gène nucléaire qui se trouve simplement à deux exemplaires. Par suite une mutation dans un gène codé par l'ADNmt n'est donc pas nécessairement représentée sur toutes les molécules d'ADNmt ; il y a en général co-existence de gènes mutés et de gènes normaux, dans le même tissu, dans la même cellule voire dans la même mitochondrie.Cette propriété connue sous le nom d'hétéroplasmie (sous entendu de l'ADNmt) (figure ci-dessous) joue un rôle important dans l'expression des mutations mitochondriales. Compte tenu du nombre important de molécules d'ADNmt dans une cellule, l'hétéroplasmie peut prendre n'importe quelle valeur entre 0 et 100% et n'est pas nécessairement la même d'une cellule à l'autre, et encore moins d'un tissu à l'autre ou entre les membres d'une même famille. On peut imaginer que seuls les tissus avec une forte proportion d'ADNmt mutés seront affectés. L'expression des mutations de l'ADNmt (et aussi de l'ADN nucléaire quoique plus classiquement) se pose donc nécessairement en termes quantitatifs.
Les pathologies mitochondriales forment un groupe hétérogène de désordres métaboliques caractérisé par des anamolies des oxydations phosphorylantes. Des mutations précises associées à des syndromes particuliers ont été déterminées durant les quinze dernières années sur l'ADNmt est plus récemment sur l'ADN nucléaire.
Les thèmes de l'équipe
Le contrôle biochimique des oxydations phosphorylantes - Effet de seuil et spécificité tissulaire.
Thierry Letellier, Monique Malgat, Rodrigue Rossignol, Benjamin Faustin et Jean Pierre Mazat.
Résultats :
L'expression des mutations fait intervenir de nombreuses étapes (Fig.4) ; c'est donc un phénomène complexe. Nous avons étudié plus particulièrement l'expression des déficits enzymatiques au niveau des oxydations phosphorylantes. En utilisant des inhibiteurs spécifiques des différents complexes de la chaîne respiratoire (Fig. 2), nous avons pu montré que les flux globaux (consommation d'oxygène et synthèse d'ATP) sont assez insensibles à une diminution de l'activité d'un complexe des oxydations phosphorylantes jusqu'à un certain seuil (souvent situé à plus de 50% d'inhibition) au-delà duquel le flux décroît rapidement (Fig. 5).
Nous avons montré qu'un tel comportement est bien expliqué dans le cadre de la théorie du contrôle du métabolisme (1C-3C) et qu'il est même inéluctable pour la plupart des complexes. Un tel comportement a été aussi observé en fonction du degré d'hétéroplasmie de l'ADNmt (4C) ; dans ce cas un fort degré d'hétéroplasmie est nécessaire afin d'observer une diminution de la consommation d'oxygène avec un seuil au delà de 90%. On comprend pourquoi les membres d'une même famille, bien que tous porteurs d'une mutation mitochondriale ne sont pas tous atteints. Cela montre l'importance du concept de seuil dans l'expression des déficits du métabolisme non seulement d'un point de vue fondamental mais aussi dans une vision thérapeutique car dans ce but il n'est pas nécessaire de supprimer totalement le déficit, il suffit simplement de passer du bon côté du seuil.
Comme les mitochondries de différents tissus sont différentes, on peut faire l'hypothèse que la sensitibilité de leurs flux aux déficits dans un complexes seront aussi différents et donc par suite les valeurs de flux. Nous avons confirmé cette hypothèse en étudiant les valeurs de seuil et les coefficients de contrôle des différents complexes des oxydations phosphorylantes dans cinq tissus différents : muscle, c½ur, foie, rein et cerveau. Cette étude montre de larges variations dans les valeurs de seuil pour le même complexe dans différents tissus : par exemple, un déficit de 50% dans le complexe I n'aura aucun effet dans le muscle alors qu'il diminuera la vitesse de respiration de 30% dans le cerveau. Cela fournit une explication (parmi d'autres) de la spécificité tissulaire observée dans les pathologies mitochondriales.
De plus, dans le muscle, nous observons une augmentation apparente de la quantité du translocateur des nucléotides adényliques (ANT) quand on passe du pyruvate au succinate et finalement au TMPD (tétraméthyl-p-phenylenediamine) en présence d'ascorbate comme substrat respiratoire. Cette observation est aussi faite dans le cerveau mais pas dans le foie. Ce résultat inattendu pourrait être l'indication du recrutement de sous-unités libres d'ANT ou de sous-unités d'ANT engagées dans d'autres structures (Pore de Transition de Perméabilité, super-structures, etc.). Des résultats préliminaires d'analyse des complexes des oxydations phosphorylantes par gels en 2 dimensions montre l'existence de deux bandes contenant l'ANT. Il faut souligner l'importance de ce résultat en relation avec les pathologies mitochondriales : c'est en effet une raison supplémentaire de différence tissulaire car les mitochondries de différents tissus utilisent préférentiellement différents substrats respiratoire.
Expressions Phenopypic de la quantité en ADNmt :
Thierry Letellier et Christophe Rocher.
Résultats :
Des mutations dans des désoxynucléoside kinases (salvage pathway) peuvent entraîner une diminution de la quantité d'ADNmt (entre 1 et 10% de la quantité d'ADNmt normal). Une telle diminution de la quantité en ADNmt (appelée déplétion de l'ADNmt) fait aussi partie des effets secondaires des traitements des patients atteint de SIDA par les analogues de nucléotides (AZT). Toutefois la quantité d'ADNmt dans des tissus normaux apparaît comme un paramètre assez variable. Par suite, on peut suspecter aussi un effet de seuil dans l'expression phénotypique de la quantité d'ADNmt, indiquant la limité inférieure de la quantité d'ADNmt absolument nécessaire pour maintenir un fonctionnement normal des oxydations phosphorylantes. Nous avons abordé cette question sur deux modèles expérimentaux. Le premier est constitué d'une lignée lymphoblastoïde immortalisée à partir des lymphocytes d'un patient chez lequel la quantité d'ADNmt était dans une biopsie musculaire de 1% par rapport à la normale. Dans le second modèle nous avons traité une lignée lymphoblastoïde normale avec des analogues de nucléotides. L'AZT s'est révélé toxique pour ces cellules. Dans le traitement de lymphoblastes avec le ddC (didéoxycytidine), la quantité d'ADNmt apparaît directement proportionnelle à la concentration en ddC. Nos premiers résultats ne montrent pas de seuil lorsque l'on porte la respiration mitochondriale en fonction de la quantité d'ADNmt mais plutôt une décroissance quasi linéaire. Ce résultat montre que la quantité d'ADNmt pourrait être un paramètre critique dans l'expression des oxydations phosphorylantes.
Modélisation Mathématique des Oxydations Phosphorylantes
Marie Beurton-Aimar et Jean-Pierre Mazat en collaboration avec Christine Nazaret (ESTBB-Bordeaux 2) et Bernard Korzeniewski (Cracovie)).
Résultats :
Modélisation mathématique de l'expression des déficits en fonction de leur origine nucléaire ou mitochondriale : Nous avons montré que les mutations affectant les oxydations phosphorylantes seront exprimées différemment selon leur origine, mitochondriale ou nucléaire (Fig. 4). Dans ce but, nous avons développé trois modèles théoriques simulant trois mécanismes de mutation, mitochondriale ou nucléaire entraînant une diminution d'activité enzymatique affectant les fonctionnement des oxydations phosphorylantes : 1) Un déficit partiel distribué de manière homogène dans toutes les mitochondries, 2) un déficit total, n'affectant qu'une partie des mitochondries, modèle que nous appelons “ hétéroplasmie mitochondriale ”, et 3) un déficit partiel n'affectant qu'une partie des mitochondries. Dans tous les cas, les déficits sont exprimés avec un seuil, mais nous montrons que la valeur du seuil dépend de l'origine de la mutation et aussi de la demande énergétique du tissu étudié. Nous avons confirmé cette dernière prédiction avec un modèle expérimental dans lequel on utilise différentes concentration d'hexokinase pour simuler la variation en demande énergétique et des concentrations variables en mitochondries qui simulent l'hétéroplasmie mitochondriale.
Reference : Bernard Korzeniewski, Monique Malgat, Thierry Letellier and Jean-Pierre Mazat, (2001) : Effect of binary mitochondrial heteroplasmy' on respiration and ATP synthesis : implications for mitochondrial diseases. Biochem. J. 357, 835-842.
Projet : Mitochondrie Virtuelle : modélisation du métabolisme mitochondrial, de sont contrôle et de sa régulation :
Il s'agit d'un projet à long terme qui comprend les étapes successives suivantes :
La première partie du travail sera consacrée à la revue des modèles des oxydations phosphorylantes déjà développés ; il est possible que nous soyons amenés à construire un nouveau modèle prenant en compte les avantages et les défauts des modèles analysés. Ces modèles seront utilisés pour simuler l'ensemble des résultats obtenus dans notre laboratoire depuis plusieurs années sur la sensibilité différentielle des oxydations phosphorylantes à l'inhibition de leurs différentes étapes. Nous disposons en effet d'un nombre important de données sur différents tissus et leur comparaison, à l'aide d'un modèle mathématique, devrait permettre de mettre en évidence les paramètre critiques permettant d'expliquer les différences observées entre les différents tissus (quantitié et activité des différents complexes par exemple). Dans une seconde étape nous ajouterons au modèle des oxydations phosphorylantes un modèle du reste du métabolisme mitochondrial (cycle de Krebs, beta-oxydation des acides gras, etc.). Dans une troisième étape, nous intégrerons cette mitochondrie virtuelle dans un modèle de cellule virtuelle ce qui imposera de modéliser les échanges entre les deux (transports et navettes). Pour développer ce projet, nous nous appuierons sur la connaissance des génomes eucaryotes dont une partie importante (autour de 10% dans la levure) code pour des protéines d'intérêt mitochondrial. Nous étudierons aussi les génomes procaryotes ancêtres des mitochondries.
Radicaux libres et signalisation mitochondriale - Spécificité tissulaire
Jeanne Dachary et Olivier Augereau.
Au cours du transport des électrons par la chaîne respiratoire, des substances oxygénées réactives, (ROS) sont générées (1S et Fig. A). La production mitochondriale de ROS augmente au cours du vieillissement, dans les cas de neurodégénérescence (en particulier dans les pathologies d'Alzheimer et de Parkinson), de cancer, au cours de l'ischémie-reperfusion, de l'inflammation, et sous l'effet de molécules toxiques (2S). Les conséquences connues en sont l'inactivation des constituants du transport des électrons, l'inhibition du métabolisme énergétique, l'oxydation de l'ADN mitochondrial et la peroxydation des lipides membranaires.
Depuis peu, il a été établi que les ROS peuvent aussi jouer un rôle dans la signalisation, en particulier par activation des facteurs de transcription, de la cascade des MAP kinases, par inhibition des protéine-phosphatases, résultant en une augmentation des phosphorylations des protéines (3S). Or, il est de fait que certains complexes de la chaîne respiratoire sont phosphorylés et l'existence d'une tyrosine-kinase sur la membrane externe et de deux types de PKA (PKA I et II) dans la membrane interne a été démontrée (4S). Comme l'activité des complexes dépend des phosphorylations, il a été suggéré que dans certains cas l'interaction d'un premier messager sur son récepteur cellulaire pourrait transduire un signal atteignant la mitochondrie en réponse à un besoin métabolique de la cellule hôte. La mitochondrie étant le siège d'une production de ROS, ces derniers pourraient moduler l'activité des enzymes impliquées dans la signalisation mitochondriale : kinases et phosphatases. Cette régulation fine pourrait être perturbée dans les situations pathologiques citées plus haut, dans lesquelles une production de ROS est augmentée.
Résultats préliminaires :
Nous avons montré qu'il existe, dans deux tissus chez le rat, le muscle et le cerveau, une nette différence dans la production de radicaux libres ainsi que dans les activités antioxydantes des mitochondries. Dans le cerveau, nous mesurons une production mitochondriale de H2O2 moins importante et corrélativement une activité plus importante de deux enzymes impliquées dans la détoxification : la MnSOD et la glutathion peroxydase. L'addition à des mitochondries isolées d'ATP exogène conduit à une augmentation de phosphorylation sur tyrosine et sur sérine de certaines protéines de mitochondries de cerveau et de muscle qu'il reste à indentifier. Les kinases ou phosphatases impliquées sont sensibles aux radicaux libres puisque cette phosphorylation augmente en présence de H2O2. Une diminution de la respiration mitochondriale est observée lors d'une stimulation de la PKA mitochondriale par l'addition de dibutyrylAMPc, analogue de l'AMPc. Nous sommes en train de rechercher les activités enzymatiques phosphorylées qui pourraient expliquer une telle diminution : cytochrome c oxydase, complexe I etc.
Les mitochondries éléments clés pour l'exposition des PS dans les plaquettes sanguines humaines
Le rôle des plaquettes dans l'hémostase comprend la formation d'une surface pro-coagulante par l'exposition de phosphatidylsérine (PS) et une vésiculation membranaire.
Il a été montré que l'exposition des PS, qui a aussi lieu dans l'apoptose, était due à l'activation d'une phospholipide scramblase stimulée par le Ca2+ ou l'apoptose. On peut donc à juste titre se demander si les mitochondries ne pourraient pas être impliquées dans la réponse plaquettaire comme elles le sont dans certaines voies apoptotiques. Afin d'étudier les mécanismes conduisant à l'exposition des PS, nous avons utilisé des anesthésiques locaux qui permettent l'exposition des PS dans les plaquettes en absence de calcium extracellulaire.
Nous avons montré que l'exposition des PS plaquettaires par les anesthésiques locaux en absence de Ca2+ extracellulaire était associée à une augmentation initiale soutenue de la concentration du Ca2+ mitochondrial simultanément à celle du cytosol, puis à une dépolarisation de la membrane mitochondriale, à la libération du cytochrome c et à l'activation des caspases 3 et 9. Ces effets drastiques des anesthésiques locaux sur les mitochondries suggère une forte implication de ces dernières dans l'exposition des PS par un mécanisme présentant des analogies avec un mécanisme apoptotique.
Dysfonctionnements Mitochondriaux en Anesthésie-Réanimation
François Sztark,Georges Gbiki-Benissan, Monique Malgat, Karine Nouette-Gaulain, Hoang-Name Bui et Sylvaine Français.
Mécanismes d'action des anesthésiques sur le métabolisme mitochondrial
Les anesthésiques locaux sont utilisés en médecine pour la réalisation d'anesthésie locale ou générale. Les manifestations toxiques, liées à une injection intravasculaire accidentelle par exemple, sont rares mais potentiellement létales (Auroy et al. 1997). Il s'agit d'atteintes neurologique et surtout cardiaque dont la réanimation est toujours difficile. Nous avons montré que la cardiotoxicité de ces molécules pouvait être expliquée en partie par une atteinte du métabolisme énergétique mitochondrial (Dabadie et al. 1987) selon deux mécanismes : un découplage entre la consommation d'oxygène et la synthèse d'ATP par un effet de type protonophore (Schonfeld et al. 1992; Sztark et al. 1994) et une inhibition directe du complexe I de la chaîne respiratoire (Sztark et al. 1998). Ces effets ne sont pas stéréospécifiques et la liposolubilité apparaît comme le principal facteur physicochimique pouvant moduler l'action de ces molécules au niveau mitochondrial (Sztark et al. 2000a). Ainsi, la ropivacaine, récemment mise sur le marché, bien que très proche de la bupivacaine mais moins liposoluble, offre une marge de sécurité plus importante.
Hypoxie chronique et métabolisme énergétique cardiaque
En clinique, plusieurs facteurs comme l'hypoxie ou l'acidose aggrave la toxicité cardiaque des anesthésiques locaux. Nous avons développé, en collaboration au sein de l'IFR 4 avec l'équipe du Pr Marthan (EMI 9937, Université Bordeaux 2 ), un modèle de rat hypoxique chronique afin d'étudier le métabolisme énergétique des ventricules droits et gauches sur des fibres cardiaques perméabilisées. Après 14 jours d'hypoxie hypobare (altitude simulée 5 500 m), il existe une altération significative des capacités oxydatives du ventricule gauche alors qu'elles sont maintenues dans le ventricule droit hypertrophié. Ces résultats sont en accord avec ceux de Rumsey et al (Rumsey et al. 1999). Nous avons montré, dans le ventricule gauche hypoxique, que la masse mitochondriale était diminuée et que les effets toxiques de la bupivacaine étaient potentialisés (Sztark et al. 2000b).
Altération du métabolisme mitochondrial au cours du sepsis chez l'homme
L'équipe du Pr Gbikpi-Benissan (CHU de Bordeaux) rejoint notre groupe pour étudier les dysfonctions mitochondriales au cours du choc septique. Le sepsis sévère reste une cause majeure de mortalité chez les patients de réanimation, dans le contexte d'une défaillance polyviscérale, progressivement réfractaire aux traitements habituels ( remplissage vasculaire, agents inotropes et vasoactifs, antibiotiques) (Angus et al. 2001). Des avancées notables ont été réalisées dans le traitement des perturbations hémodynamiques du sepsis (Rivers et al. 2001). En revanche, les essais prospectifs basés sur l'utilisation de substances destinées à moduler le déséquilibre de la réponse inflammatoire rencontrée au cours des états septiques, n'ont apporté qu'un bénéfice modeste (Bernard et al. 2001).
Plusieurs études expérimentales ont montré que les états septiques sévères s'accompagnaient d'une apoptose accrue, en particulier au niveau des organes lymphoïdes, responsable d'une immunosuppression (Oberholzer et al. 2001). De même, on observe rapidement une altération du métabolisme énergétique mitochondrial avec une diminution de la production d'ATP. Cet état correspond à une véritable cytopathie hypoxique qui se produit au cours des sepsis sévères, en dépit de valeurs normales voire supranormales de PO2 intracellulaires (Fink 2001; L'Her and Sebert 2001; Adrie et al. 2001).
